骨髓干细胞移植修复梗死心脏的临床研究现状与发展趋势

　　如何改善心肌梗死后缺血心脏功能，一直是心血管领域研究热点问题，现有的治疗措施都不能获得满意疗效。干细胞移植为修复梗死心脏提供了一种振奋人心的治疗措施。

1. 骨髓单个核细胞群

   如何改善心肌梗死后缺血心脏功能，一直是心血管领域研究热点问题，现有的治疗措施都不能获得满意疗效。干细胞移植为修复梗死心脏提供了一种振奋人心的治疗措施。骨髓干细胞移植已经治疗心肌梗死和梗死后心力衰竭的一种新的有价值的方法，世界上已有数千例患者接受了临床治疗试验。骨髓干细胞的组成很复杂，包括造血干细胞、间充质干细胞以及其他类型的干/祖细胞。目前用于临床移植的骨髓干细胞大体分为5种：骨髓单个核细胞群(Bone marrow mononuclear cells, BM-MNCs)、骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）、造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs）、内皮祖细胞（Endothelial prognitor cells, EPCs）和ACC133⁺细胞。
　　1. 骨髓单个核细胞群
　　BM-MNCs系将骨髓全血利用淋巴细胞分离液经过梯度密度离心法得到的多个单个核细胞混合。BM-MNCs集成了几乎所有的骨髓干细胞成份，含有诸如间充质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞之类的干/祖细胞。由于骨髓单个核细胞移植具有容易从自体采集、操作简单和不存在免疫排斥反应等优势，因此，比较适合临床应用。

　　2001年，Fuchs和Kamihata用小型猪进行了临床前期试验研究，分别证实了心内膜下注射和直视下心外膜注射骨髓单个核细胞的安全可行性，同时也证实了骨髓细胞移植能增加慢性缺血（慢性阻塞3周）和急性缺血心肌侧枝循环灌注和心脏功能。同年，日本的Hamano研究小组^[1]率先将骨髓细胞移植应用于临床研究，在5例陈旧性心肌梗死患者行冠状动脉旁路移植术（CABG）的同时，进行了自体骨髓单个核细胞移植，5例患者有3例心肌灌注长期改善，2例无明显变化。同年德国的Strauer等^[2]对1例急性心肌梗死后6天的患者进行冠状动脉内骨髓单个核细胞移植，在给患者进行冠状动脉介入治疗后，通过球囊导管将自体骨髓单个核细胞通过梗死相关血管注射入心肌。随访10周后，单光子发射计算机断层（SPECT）、超声心动图多巴胺负荷试验和核素心室造影显示左室跨壁心肌梗死范围从24.7%减少至15.7%， LVEF值升高20%-30%。2002年，该研究小组^[3]又报导了更多病例的临床研究结果，共观察了20例心肌梗死患者，在急性心肌梗死后7±2天， 10例患者接受经冠状动脉内移植自体骨髓单个核细胞＋标准治疗，另10例患者只接受标准治疗。随访3个月，细胞移植组梗死面积（左室造影显示）明显降低（从30%±13％降低到12%±7％，P=0.005），也明显低于标准治疗组（P=0.005）；梗死室壁运动速度明显增加（从2.0±1.1 cm/s增加到4.0±2.6cm/s，P=0.028）；多巴酚丁胺负荷超声心动图试验、同位素心室造影术和右室导管检查显示心脏功能均明显改善，梗死区域心肌灌注明显增强。此项研究系临床I期安全性和可行性研究，第一次比较完整的证实经冠状动脉自体骨髓细胞移植的治疗方法是安全可行的。2003年，Tse等^[4]首先利用NOGA系统将自体骨髓单个核细胞移植到8例严重缺血性心脏病患者的缺血心肌中，随访3个月，患者症状明显改善，MRI显示缺血壁心肌灌注提高，LVEF值提高6%，未发现任何与手术相关的急性并发症和后遗症，也无室性心律失常、心肌坏死和心肌肿瘤发生。同年，Perin等^[5]对14例终末期缺血性心脏病患者通过NOGA导管行心内膜下骨髓单个核细胞移植治疗，7例作对照。随访4个月，治疗组EF值明显增加，舒张末期容积明显减少，注射部位室壁电-机械活动明显改善，无心律失常发生。
　　但是，以上临床试验样本量小，虽然疗效显著，但不是随机、双盲、安慰剂对照研究，证据级别不高。2004年，Wollert等^[6]报导60例临床随机、对照研究结果，细胞移植组和对照组各30例，在心肌梗死后4-8天，经冠状动脉注射骨髓单个核细胞，随访6个月显示，与对照组相比，左室射血分数提高6.7%，收缩性能明显增强，并不增加诸如感染、支架内再狭窄、心律失常、微血栓形成等临床不良反应发生率。但是，这个临床试验虽具有随机性，但缺乏双盲性，研究中的对照组并没有接受骨髓穿刺，也没有实施冠状动脉内安慰剂治疗，因此，这种对照并不真正的对照，仍不能排除安慰剂效应。我们在中山医院伦理委员会和上海市卫生局的批准下，自2003年5月27日，开展了经微导管冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞治疗急性心肌梗死的随机、双盲、对照研究，随访6个月的初步临床研究表明，骨髓干细胞移植能明显增加缺血心肌血管新生，提高患者LVEF 6.1%，未见致心律失常等潜在危险性。远期预后正在随访中，我们一方面将扩大样本量，寻找安全有效的骨髓干细胞示踪方法，以评价移植细胞的最终转归；另一方面，成立骨髓干细胞“可塑性”临床应用研究协作组，开展多中心、大样本、随机、双盲、对照研究，以客观评价骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏病的有效性及安全性^[7]。
　　对于骨髓单个核细胞移植改善缺血心脏功能的机制多数学者认为骨髓细胞移植改善缺血心脏功能的作用机制可能与血管生成有关，而血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）在血管生成过程中起着非常重要的作用。Fuchs和Kamihata的研究提示，骨髓细胞移植能够促进缺血心肌表达VEGF，但是持续时间很短，不超过1周。我们的实验研究提示骨髓细胞移植不同水平地上调VEGF和VEGF受体Flk-1的表达，持续稳定的促进血管新生，促进缺血心脏功能恢复；而在骨髓细胞移植早期，BM-MNCs移植能够上调细胞保护性蛋白（如HSP70和HSP32）的表达，促进急性缺血心脏功能恢复。至于细胞分化是否在其中起作用，多数研究结果表明BM-MNCs在缺血心肌内向心肌细胞和血管内皮细胞分化的发生概率很低（约为万分子之一），因此细胞分化在其中并不起主要作用。

　　骨髓单个核混合细胞移植虽然简单易行，但是细胞成分复杂，移植这种类型细胞对作用机制探讨和细胞分化鉴定带来一定困难。因此，人们正在通过动物实验行那些纯度高、组成均一的单一细胞移植后的分化和功能鉴定工作，为临床应用研究提供更多的科学依据。

2.内皮祖细胞

　　2.内皮祖细胞
　　由于骨髓单个核细胞群的成分复杂，给移植后的细胞功能鉴定带来一定困难，因此，目前有学者又开始尝试用骨髓或外周血中某单一细胞群，如EPCs，做细胞移植的临床研究。动物实验表明骨髓来源的或血液来源的祖细胞有助于梗死心肌再生和增强缺血心肌的血管新生。Assmus等^[8,9,10]于2001-2002年进行了TOPCARE-AMI研究。该研究小组将20例急性心肌梗死后24小时内行再灌注治疗（PTCA和支架术）的患者随机分为二组，经冠状动脉内注射骨髓来源的祖细胞组和注射循环血来源的祖细胞组。注射循环血来源的祖细胞组患者于移植前3天体外制备祖细胞，接受骨髓来源的祖细胞组患者于移植当天提取骨髓，并分离出其中祖细胞成分。梗死后4.3±1.5天，利用球囊导管将所得细胞分次（3次以上）注射到梗死相关动脉中。随访4个月，两组患者LVEF提高5%，梗死区域室壁运动也明显改善，左室收缩末期容积显著减少，梗死动脉的冠状动脉血流储备也显著增加，梗死区域心肌活性明显增强，梗塞面积较前缩小；随访1年EF升高8%。在未接受祖细胞但接受其他治疗相似病例中却未观察到上述变化。上述指标在接受祖细胞治疗两组病例之间并无显著性差异，在这两组病例中也未观察到炎症反应和心律失常。此项研究结果表明，冠状动脉内注射自体祖细胞是安全可行的，而且可能改善梗死后心室重构。然而，此研究仍缺乏经冠状动脉只注射悬浮液而不含祖细胞的随机对照组，并不能排除冠状动脉支架置入术后对左室功能的影响；另外，还存在观察时间短、样本量少等缺憾。因此，仍还需要大规模的随机试验的结果来证实这种新的再生心肌措施是否确实能改善急性心肌梗死患者的短期和长期预后。

3.AC133+细胞群

　　3.AC133⁺细胞群
　　AC133系干细胞/前体细胞表面标记蛋白，表达血管内皮细胞受体3（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3, VEGFR3）。人类AC133细胞主要为CD34+细胞群，具有内皮干细胞和祖细胞表型和功能特征，主要在血管新生方面起作用。2003年，Stamm等^[11]利用磁珠分选的方法得到AC133⁺骨髓细胞，在冠状动脉搭桥术同时将这种亚群细胞移植到梗塞周边区域。随访3～9月，所有患者生活质量均有提高，4例左室功能增强，5例梗死组织血流灌注明显改善；但是，局部收缩功能并无明显提高，表明这种细胞移植主要促进梗塞相关血管新生，并不见成肌效应。因此，这种细胞因其再生心肌能力低而使其临床应用受限。

4.骨髓间充质干细胞

　　4.骨髓间充质干细胞
　　MSCs是各种间质细胞的前体细胞，具有很强的增殖能力和多向分化潜能。MSCs能分泌多种炎症细胞因子，如白介素-1和肿瘤坏死因子-α和生长因子，如碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子（VEGF）和angiopoietin-1等，在干细胞分化成心肌细胞及血管内皮细胞过程中发挥积极作用。目前可通过体外贴壁培养，或根据细胞表面的特异表达的分子，来获得相对较纯的间充质干细胞群，以期体外定向诱导，研究它的发育机制或用于临床。动物实验发现，移植到梗死心脏的MSCs能够分化为心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞三种细胞系。
　　我国学者陈绍良等^[12]于2004年率先将用自身血清培养出来的MSCs移植到34例PCI术后18天患者，同时给35例患者注射盐水作为对照，随访6个月发现，MSCs移植明显改善左室功能，未见与移植MSCs相关的副作用。与移植BM-MNCs、EPCs和AC133+细胞比较，这种细胞获益似乎更好（移植MSCs可使EF提高18%，而移植BM-MNCs和EPCs使EF值提高6%左右，移植AC133+细胞并不明显改善心脏功能），是移植的细胞类型更优越，还是与病例选择、检测手段等因素有关，有待进一步比较研究。另外，最近Vulliet等研究发现，冠状动脉内移植MSCs会引起冠状动脉微梗死，这对MSCs临床应用的安全性提出新的质疑。因此，其治疗的长期安全性和临床意义有待于大样本、随机。双盲对照研究。

　　应用贴壁培养方法得到的MSCs并不是成分均一的细胞。目前，研究者们多倾向应用流式细胞仪或磁珠分选出成分均一、表型一致的细胞，作单克隆培养，再作移植。Toma等报导了移植这种单克隆MSCs到正常心脏中，发现所移植细胞可以向心肌细胞分化。但是，该项研究中应用的动物模型是心脏功能正常的、免疫缺陷小鼠，并未报导有关单克隆MSCs移植对心脏功能和心脏血管供应的影响的报导。目前，也未见有关应用单克隆MSCs治疗心肌缺血的研究报导。

5. 造血干细胞

　　5. 造血干细胞
　　HSCs常以CD34标记物区分为CD34⁺细胞群和CD34^-细胞群，其中CD34+细胞群占95%以上，而CD34^-细胞群不到5%，通常所说的造血干细胞指的就是CD34⁺细胞群。通常认为HSCs是所有血细胞的祖先。造血干细胞起码具有两个特性：①高度的自我更新能力或自我复制能力，这样可以保持干细胞数量恒定；②进一步分化为各系祖细胞及成熟血细胞的能力，这是造血干细胞生命意义的体现。2001年Orlic等和Jackson 等两个研究小组报导了骨髓造血干/祖细胞在不同的条件下可分化为心肌细胞。Jackson 等将CD34^-/lowc^-kit⁺ Sca-1⁺HSCs（所谓的SP细胞）移植给受致死性照射的小鼠，再行冠状动脉结扎60min后再通。结果发现，分化的心肌细胞首先出现在梗死区周围，约占总数的0.02%，并有LacZ和α肌动蛋白的表达而无FLT-1基因表达（FLT-1是内皮细胞的标志，在SP干细胞中缺乏），证明了HSCs的心肌再生潜能。但是，2004年Nygren，Murry和Balsam等的动物实验发现HSCs 移植并不能实现再生心肌和血管效应，故目前很少应用于临床心脏病的治疗。

6. 某些细胞因子

　　6. 某些细胞因子
　　除用骨髓干细胞作移植对象外，科学家们又开始尝试用某些能促进干细胞分化的细胞因子来刺激自身骨髓干细胞分化。骨髓干细胞分化为心肌细胞和血管内皮细胞，由两个关键因素决定，损伤的组织环境和足够数量的多能干细胞。基于这一点，Orlic等又尝试了在小鼠冠状动脉结扎后静脉注射干细胞因子（SCF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），发现小鼠骨髓中的干细胞能归巢到梗死区域，并发生了复制和分化。与移植骨髓干细胞相比，注射干细胞因子具有无创伤性，死亡率低的优点。但是2004年，Kang等研究发现G-CSF动员加重支架内再狭窄，而且大剂量应用可能会导致造血系统过度增殖，因此其安全性需要大规模试验才能得出最后结论。
　　虽然目前干细胞移植治疗心肌梗死的临床研究取得了令人鼓舞的成就，但是距临床广泛应用仍还有一段很长时间，动物实验对其安全性及有效性仍无最后结论，干细胞改善心脏功能的作用机制仍未明确，实验结果评判手段多种多样，临床治疗效果也莫衷一是，因此，有待于我们研究的内容很多很多。

参考文献

1  Hamano K, Nishida M, Hirata K, et al. Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease: clinical trial and preliminary results. Jpn Circ J, 2001; 65: 845～847

2  Strauer BE, Brehm M, Zeus T, et al. Myocardial regeneration after intracoronary transplantation of human autlologous stem cells following acute myocardial infarction. Dtsch Med Wschr, 2001; 126: 932～938